ポジトロニウムバイオマーカー開発のための 3D 黒色腫スフェロイドモデル

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7648 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

新しく発明されたポジトロニウムイメージングは​​、現在ポジトロン断層撮影法（PET）で利用可能な標準化された取り込み値に関する組織病理に関する追加情報を提供することにより、がん診断を改善するために使用できる可能性があることが最近実証されました。 ポジトロニウム イメージングは​​、PET 検査中に体内で生成される電子と陽電子から構成されるポジトロニウム原子の特性を利用します。 我々は、ポジトロニウムイメージングは​​、異なる癌活性と生物学的特性を持つ黒色腫細胞株から構築された腫瘍様三次元構造（スフェロイド）の in vitro 識別に敏感であると仮説を立てました。 悪性度の異なる 2 つの細胞株 (WM266-4 および WM115) からの黒色腫スフェロイドでオルト ポジトロニウム (o-Ps) の寿命を評価しました。 さらに、細胞数、スフェロイドサイズ、黒色腫の悪性度などのパラメータを考慮して、o-Ps 寿命との関係を評価しました。 我々は、細胞外マトリックスを含まないスフェロイドにおけるo-Ps寿命測定のパイロット結果を実証します。 2 つの標準偏差の統計的有意性により、悪性度が高く、新生物細胞の増殖速度が高いほど、オルト ポジトロニウムの寿命が短くなることが実証されました。 特に、さらなる研究を促す以下の兆候を観察しました: (i) より高い増殖速度と悪性腫瘍を特徴とする WM266-4 スフェロイドは、より低い増殖速度を特徴とする WM115 スフェロイドよりも短い o-Ps 寿命を示しました。 (ii) どちらの細胞株も、培養4日目と比較して、8日目のスフェロイド生成後のo-Pの寿命の減少を示し、平均o-Pの寿命は、WM266から形成されたスフェロイドよりもWM115細胞から形成されたスフェロイドの方が長かった。 -4 細胞、スフェロイドの年齢に関係ありません。 この研究の結果により、ポジトロニウムはがんの悪性度を評価するための PET 診断に応用できる可能性のある有望なバイオマーカーであることが明らかになりました。

過去数十年にわたり、三次元 (3D) 細胞培養は、インビトロとインビボの細胞状態の間のギャップを埋めることができるインビトロモデルとして広く使用されてきました1。 3D 細胞培養と細胞単層を比較すると、細胞間および細胞-マトリックスの相互作用、細胞シグナル伝達、増殖、壊死などの特定の生理学的および形態学的特徴が明らかになりました。 単層細胞培養とは異なり、3D スフェロイドは実際の腫瘍細胞環境と細胞間の栄養拡散速度を模倣するのに適したモデルです。 多細胞腫瘍スフェロイドを使用すると、細胞増殖、酵素反応、およびさまざまな治療法の生化学的メカニズムを研究することができます2、3、4、5。

黒色腫は最も蔓延している種類の皮膚癌であり、最も致死性の高い癌の 1 つとして分類されています。 最も致死性の高い癌である黒色腫は、遺伝的感受性と主に紫外線への環境曝露の両方が重要な役割を果たす多因子疾患です6。 黒色腫がんの指定された環境危険因子は、太陽紫外線放射 (UVB) と日焼け (UVA) への曝露です。 UVB 照射は直接的な DNA 損傷を引き起こし、DNA 鎖の切断につながります。 UVB はまた、マクロファージと好中球の皮膚細胞への浸透の増加により、黒色腫細胞の生存、血管新生、浸潤を促進します。 UVA はフリーラジカルの生成を通じて DNA 損傷を引き起こし、メラノサイトに酸化ストレスを引き起こします。 黒色腫のリスクは、遺伝性の突然変異や体細胞突然変異にも関連している可能性がありますが、遺伝的傾向が原因となるケースは少数です。 進行した段階での黒色腫治療の有効性は低いため、新しい標的療法、免疫療法、および併用療法の開発が常に必要とされています7（図1）。

表皮層におけるメラノサイトと黒色腫病変の形成の概略図。 (A) 正常なメラノサイトは規則的な樹状突起を持ち、多数のケラチノサイト間に広がる多くの分岐突起を形成します (左)。 1 つのメラノサイトは 36 ～ 40 のケラチノサイトに達し、表皮の基底層の 8 ～ 10 のケラチノサイトのそれぞれに対して 1 つのメラノサイトがバランスのとれた割合で表皮メラニン単位 (EMU) を形成します。 黒色腫病変（右）では、メラノサイトは樹状性を失い、悪性のアメーバ状になり、異なる接着分子（メラノサイトによって発現される E-カドヘリンの代わりに N-カドヘリン）を発現することによって細胞間の接触が変化します7。 メラノソームは、メラノサイトによって生成されたメラニン顆粒を保管し、周囲のケラチノサイトに分配して紫外線によるダメージから保護します。 (B) メラニン分子における陽電子消滅の図解。 炭素、酸素、水素、窒素、p-Ps および o-Ps 原子は、凡例で説明されている色で示されています。 破線の矢印は、電子陽電子の直接消滅による光子を示します。 赤い矢印は、o-Ps 原子の自己消滅からの光子を示します。 青い矢印は、p-P の自己消滅からの光子を示します。 緑色と茶色の矢印は、それぞれピックオフ プロセスと変換プロセスによる o-P の減衰を示します。

黒色腫を初期段階で診断するために数多くの研究が行われてきましたが、さらなる調査と追跡調査が必要です。 黒色腫による患者の転移率は高く、年間新規症例数は 350,000 人であり、新規症例数は毎年大幅に増加しています 8、9、10。

この研究では、悪性度の異なる 2 つの黒色腫細胞株 WM266-4 および WM115 の 3D スフェロイド モデルが評価されました。 黒色腫細胞株 WM266-4 および WM115 は、増殖、遊走速度、細胞サイズが異なるさまざまな生物学的特性を持っています。 人間の代謝において脂質やタンパク質と糖が結合する際に生成される終末糖化産物（AGEs）、およびAGEs受容体（RAGE）やc-Jun N末端キナーゼ（JNK）などのタンパク質の活性化。 WM266-4 株は、この細胞株を WM115 株より侵襲性高くします11。 さらに、WM115 における SLC7A5 遺伝子 (大型アミノ酸トランスポーター 1 の変異体) の発現は、WM266-412 よりも WM115 において低い SLC7A8 遺伝子の発現とは対照的に、WM266-4 よりも高い。 これらの遺伝子はアミノ酸の移入に関与し、細胞の色素沈着に必須であり、WM115 細胞株は WM266-4 細胞株よりも色が濃いです。

この研究では、細胞生理学レベルで存在する WM115 黒色腫癌と WM266-4 黒色腫癌の悪性度の違いがポジトロニウム バイオマーカーによって調査できるという仮説を立てました。 ポジトロニウムは、陽電子と電子から構成されるエキゾチックな原子です13。 ポジトロニウムは、PET 診断中に分子内空間でも形成されます 13。 図 114 に図示されているように、組織内ではポジトロニウムが形成され、分子内空間の自由空隙に捕捉されている可能性があります。分光法（PALS）実験）は物体を透過し、エネルギーを失った後、細胞を構成する分子からの電子によって消滅します。 電子陽電子消滅による光子への反応は、直接起こる場合もあれば（e + e− → 光子（図 1B の黒い破線矢印））、ポジトロニウム原子を介して起こる場合もあります（e + e− → ポジトロニウム → 光子（図 1B の実線矢印））。 4 分の 1 の場合、ポジトロニウムはパラ ポジトロニウム (p-Ps) と呼ばれる短寿命 (125 ps) 状態として形成され、4 分の 3 の場合、長寿命 (142 ns) 状態として形成されます。 ) オルト-ポジトロニウム (o-Ps)。 パラポジトロニウム（図1Bの青で示されている）は主に2つの光子に崩壊し（青の矢印）、オルトポジトロニウムは真空中で主に3つの光子に崩壊します（赤の矢印）。 しかし、分子内空隙では、オルト・ポジトロニウムはピックオフ（o-Psからの陽電子が周囲の分子からの電子とともに2つの光子（緑色の矢印）に消滅する）や分子との相互作用を介したパラ・ポジトロニウムへの変換などのプロセスを経ます。酸素分子など。 結果として生じるパラポジトロニウムは 2 つの光子に崩壊します (茶色の矢印)。 o-Ps の平均寿命の変動範囲は大きく、真空中での 142 ns から水中での 1.8 ns まで変化します 15,16。 したがって、オルト ポジトロニウムの寿命は、分子環境、つまりナノ分子構造と生物活性分子の濃度に強く依存します 13、14、15、16、17、18、19。 生体サンプル中のポジトロニウムの特性は、これまでほとんど研究されていません。 つい最近になって、コラーゲン足場上で細胞を培養することによって、3D 細胞構造におけるポジトロニウムの最初の研究が行われました 20。 皮膚癌細胞（基底細胞癌および扁平上皮癌）に関する他の研究は、皮膚の透過を制限する低エネルギー陽電子ビームを使用して実施されました21、22、23。

患者の組織におけるポジトロニウムの寿命に関する最初の in vitro 研究では、子宮がんおよび粘液腫がんの診断のためのバイオマーカーとして、また低酸素症のバイオマーカーとしてのポジトロニウムの応用を考慮すると、有望な結果が示されました 24,25,26,27。 最近、ポジトロニウムは、組織病理の in vivo 評価のための新しいバイオマーカーとして提案されました 13,25。このバイオマーカーは、即時光子放射性核種 28,29,30,31 および高度感度PETスキャナー28． さらに、高感度を特徴とする全身 PET システムの出現 32,33,34,35 により、ポジトロン断層撮影中の標準代謝イメージングへのポジトロニウム イメージングの同時適用が可能になります 29,36,37。

この研究の目的は、ポジトロニウム イメージングが、異なる癌活性と生物学的特性を持つ黒色腫細胞株から構築された腫瘍様三次元構造 (スフェロイド) の in vitro 識別に敏感であるかどうかを判断することでした。

2 つの黒色腫細胞株、ヒト悪性黒色腫癌細胞株である WM266-4、および原発性黒色腫由来の細胞株である WM115 を ESTDAB 黒色腫細胞バンク (ドイツ、テュービンゲン) から購入し、以前に記載したように培養しました 38。 Luna-II™ 自動セルカウンター (Logos Biosystems, Inc.) を使用して、細胞播種前に細胞数と生存率を測定しました。

両方の細胞株、WM266-4 および WM115 を 5D 球状プレート (5D sp5dplate、Kugelmeiers、スイス) に播種して、スフェロイドを形成しました 39。 5D マイクロプレートには 24 個のウェルがあり、そのうち 12 個のウェルはスフェロイド形成用にナノコーティングされた表面があり、12 個のウェルはコントロールとして使用されます。 私たちの研究では、対照ウェルは使用されませんでした。 各ウェルには 750 個のマイクロキャビティ (直径 509 μm、深さ 320 μm) が含まれており、これらは鋭い境界によって互いに分離されており、これらの境界により、あるマイクロキャビティから別のマイクロキャビティへの細胞の移動が妨げられます。 したがって、形状と直径が均一な 9000 個のスフェロイドを 1 枚のプレートで培養できます。

細胞播種のために、0.5mlの完全培地を各ウェルに添加した。 次いで、１，１２５，０００細胞／ウェル（１５００細胞／マイクロウェル）を含む追加の０．５ｍｌの培地をプレートの各ウェルに添加した。 Falcon チューブ内の細胞を再懸濁して培地全体に分散させた後、ウェルに加えました。

細胞播種後、プレートを 37 °C、湿度 5% CO2 のインキュベーター内に維持しました。 スフェロイドが形成された後、細胞培養培地を毎日更新した。 平均 o-Ps 寿命を測定するために、スフェロイド成長の 2 つの適切な時点が選択されました。 スフェロイドの形態と増殖速度も、細胞播種後 4 日目と 8 日目に光学顕微鏡 (オリンパス、IX-LWPO、T2、日本) で測定しました。 画像解析はImageJソフトウェアにより実施した。

まず、トリプシン/EDTA (Gibco、カタログ番号 25200072、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、スフェロイドを単一細胞懸濁液に解離させました。 次に、100 μl のトリプシン/EDTA スフェロイドを 37 °C で 10 ～ 20 分間インキュベートし、数回ピペッティングして細胞を分離しました。 次に、細胞を 300g で 3 分間遠心分離し、上清を除去し、100 μl の培地 (Gibco、カタログ番号 10010056、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を細胞に加え、数回ピペッティングして細胞を分離しました。完全に。 最終ステップでは、10 μl の細胞を 10 μl のトリパン ブルーに加え、計数しました (Luna-II™ 細胞カウンター、Logos Biosystems、Aligned Genetics, Inc)。 ワークフローを図 2 に示します。各生存率テストは、同じ条件下で各測定において 4 つの異なるサンプルに対して実行されました。

5D マイクロプレートから 3D スフェロイドを採取した後のスフェロイドの生存率を調査するためのワークフロー。

インキュベーター内で 15 分後、細胞をチェックして凝集物がないことを確認しました。 セルカウンターを使用した生存率テストの後、細胞クラスターマップを評価してクラスターの割合を決定しました。 私たちの実験では、クラスター マップは 90% を超える高い割合の解離を示しました。 その後、両方の細胞株の 3D 形状の細胞サイズをセルカウンターと顕微鏡検査によってチェックしました。 セルサイズの推定については、

Luna II TM セルカウンターを使用しました。 サイズ分布のヒストグラムに関して、細胞の平均直径を推定しました。 比較のために、2D 培養における細胞のサイズも測定しました。 この目的のために、スフェロイド構造の破壊を避けるために、大きな口径の 3 ml ピペットを使用して各ウェルからスフェロイドを除去しました。 次に、スフェロイドを 15 ml Falcon チューブに注ぎ、500 g で 7 分間遠心分離しました。 次のステップでは、上清を除去し、1 ml の新鮮な培地をスフェロイドに添加しました。

グルコースの取り込みを評価するには、蛍光を発する d-グルコース プローブ 2-NBDG (2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース) (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 N13195) を使用しました。 スフェロイド内の酸素摂取速度の分布を評価するために、WM266-4 および WM115 細胞を 1000 および 2000 細胞/ドロップの密度で播種しました。 4日目および8日目に、スフェロイドをガラス底皿に移し、20μlの2-NBDG(200μM)を各スフェロイドに添加した。 スフェロイドを 37 °C で 45 分間インキュベートしました。 最後に、スフェロイドを PBS で洗浄し、A1 走査共焦点システム (Nikon、日本) に接続した Nikon Eclipse Ti-E 顕微鏡を使用して、494 nm/551 nm の蛍光波長でスフェロイド画像を撮影しました。

酸素摂取率の分布は、低酸素キット Image-IT™ Green Hypoxia Reagent (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 I14834) を使用して測定しました。 スフェロイド内の酸素摂取速度の分布を評価するために、WM266-4 および WM115 細胞を 1000 および 2000 細胞/ドロップの密度で播種しました。 4 日目と 8 日目に、スフェロイドをガラス底の皿に移し、20 μl の Image-IT™ Hypoxia Reagent (10 μM) を各スフェロイドに加えました。 スフェロイドを 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 低酸素色素を新鮮な増殖培地と交換し、スフェロイドを再び細胞培養インキュベーター内に次の 4 時間置きました。 回転楕円体画像は、A1 走査共焦点システム (Nikon、日本) に接続された Nikon Eclipse Ti-E 顕微鏡を使用し、488 nm/520 nm の蛍光波長で撮影されました。

スフェロイドにおけるポジトロニウムの寿命の信頼性が高く正確な結果を得るために、培地、上清、または化合物を含まないスフェロイドを使用しました。 この方法では、遠心分離し、スフェロイドから培地を完全に除去した後、マイクロプレートから採取したスフェロイドをポジトロニウム寿命測定用に調製しました。

ポジトロニウムの寿命は、垂直に配置された 2 つの BaF2 プラスチック シンチレーター (SCIONIX、オランダ) と、高電圧電源 (CAEN SY4527) によって駆動されるシリアル番号 SBO696 および SBO697 の 2 つの光電子増倍管 (日本、浜松) で構成される分光計を使用して測定されました。 光電子増倍管からの信号を読み出し、6000A データアナライザーオシロスコープ (Le Croy) で分析しました。 スフェロイドは、カプトンフォイルに置かれた 22Na 放射性核種 (放射能約 1 MBq) から放出される陽電子によって照射されました。 スフェロイドの容器として専用のアルミニウム製チャンバーを使用し、ホルダーをヒーターに接続して細胞を 37 °C に保ちました。 測定セットアップを図 3 に示します。

22Na 源を取り囲む回転楕円体は、2 つの BaF2 検出器間の専用チャンバー内に配置されています。 スフェロイドは 22Na 源に隣接しており、それらの間には空間や気泡はありません。 各測定について、511 keV 光子と 1274 keV 光子の同時記録を伴う 106 個のイベントが収集されました。

陽電子の放出後の 22Na 放射性核種は、1274 keV ガンマ量子の放出を介して (平均 2.6 ps 後に) 脱励起する 22Ne 同位体の励起状態に変化します 29,30。 陽電子は細胞を通過する間にエネルギーを失い、最終的に電子とともに消滅して 2 つの連続した 511 keV ガンマ量子になります。 陽電子と電子の消滅は、直接進行することもあれば、ポジトロニウムの生成を介して進行することもあります。 陽電子の放出から消滅までの時間は、1274 keV の脱励起光子と 511 keV の消滅光子の 1 つを記録することによって測定されます。 線源を備えたサンプルは、1274 keV ガンマと 1 つの 511 keV 光子の同時記録を可能にする方法で配置され (図 3 を参照)、背中合わせに飛行する両方の 511 keV 光子の同時記録を防ぎます。 測定の結果求められた寿命スペクトルの一例を図４に示す。

ポジトロニウムの寿命スペクトルの例。 PALS Avalanche プログラムによって実行された、検出器の分解能で畳み込まれた指数関数の合計のフィッティングから得られた重ね合わせたヒストグラムを含む実験データ (黒色のヒストグラム) 25,40。 最初の成分 (黄色の線) は p-Ps (平均寿命: 0.125 ns) からの寄与を示し、2 番目の成分 (緑の線) は線源 (カプトン フォイル) (0.374 ns) での消滅に由来し、3 番目の成分 (水色) ) は自由消滅寿命 (0.395 ns) を示し、4 番目の成分 (濃い青色) は o-P からの寄与を示します。 フィットの結果として得られるすべての寄与の合計は、赤い曲線として示されます。

各測定の前に、22Na 源のみを含む空のチャンバーを使用してシステムを校正しました。 測定を行うために、スカルパーを使用してスフェロイドを遠心管からチャンバーに移し、サンプルの間に 22Na 放射線源を置きました。 次に、ソースと回転楕円体の間に空気が入らないように、回転楕円体サンプルをソースに隣接して配置しました。 次に、細胞を 37 °C に保つためにヒーターに接続されたホルダー内にチャンバーを置きました。 最後に、図 3 に示すように、ホルダーを 2 つの BaF2 検出器の間に配置しました。

細胞播種後 4 日目と 8 日目という 2 つの異なる時点でのスフェロイド内のポジトロニウムの寿命を、研究した各ケースについて収集した 106 件のイベントに基づいて評価しました。 この研究では、培地、水、化学物質を含まないスフェロイドのみが評価されました。

ポジトロニウムの寿命は、検出器分解能関数と畳み込まれた 4 つの指数関数の合計をフィッティングすることによって、記録された各スペクトルから抽出されました 40,41。 フィッティングの結果を含む例示的なスペクトルを図 4 に示します。フィッティングした成分は、パラ ポジトロニウムの崩壊 (黄色の曲線)、線源/カプトン フォイルでの直接消滅 (緑色の曲線)、およびオルト ポジトロニウムの消滅に対応します。ポジトロニウム（ダークブルー）。 完全な実験は 3 回繰り返されました。

マイクロプレートで増殖させた代表的なスフェロイドを図 5 に示します。以前に報告されているように、WM266-4 細胞株は WM115 細胞株よりも球形で濃縮されたスフェロイドを形成しました 38。 両方の細胞株のスフェロイドは、時間の経過とともにサイズと円形度が増加しました。 一般に、スフェロイドの成長速度とサイズは、キャビティのサイズと播種されたプレートの種類によって異なります。 微小空洞が大きいほど、形成される回転楕円体も大きくなります。 スフェロイドのサイズは最初の培養播種によって制御できますが、マイクロウェルのスケールもスフェロイドの直径に影響を与える可能性があります42。

異なる黒色腫細胞株からのスフェロイドの比較。 (A) 培養 4 日目と 8 日目の 2 つの異なる細胞株、WM266-4 および WM115 の顕微鏡画像。 スフェロイドの密度と円形度は培養時間中に増加しました。 (B) 培養時間の関数として、WM266-4 スフェロイドは WM115 スフェロイドよりも大きな体積を示しました。 (C) プレート内の細胞数は、両方の細胞株の培養時間中に増加しました。 スフェロイド採取後、Luna II セルカウンターを使用して 1 つのプレート内の細胞数を計算しました。

図 5B、C は、WM266-4 および WM115 スフェロイドが時間の経過とともに成長したことを示しています。 WM266-4 スフェロイドは、WM115 スフェロイドよりも速い増殖速度を示し、悪性特性に戻りました。

図５Ｂは、細胞播種から培養後８日目までに細胞数が増加したことを示している。 スフェロイドにおける WM266-4 細胞の分裂速度は、WM115 細胞の分裂速度よりも高かった。 WM266-4 では、4 日後と 8 日後に細胞数がそれぞれ 1.5 倍と 2.74 倍増加しました。 WM115 スフェロイド内の細胞数は、4 日後と 8 日後にそれぞれ 1.4 倍と 1.7 倍に増加しました。 各ポジトロニウム寿命測定には、合計 36,000 個の回転楕円体が使用されました。

WM266-4 スフェロイドは、細胞播種後 4 日目の直径が 15.70 ± 0.10 μm、8 日目の直径が 15.92 ± 0.08 μm の細胞で構成されていましたが、WM155 スフェロイドの細胞直径は 4 日目で 16.66 ± 0.20 μm、4 日目では 17.28 ± 0.25 μm でした。 2D細胞培養における染色細胞の平均サイズは、3Dスフェロイドからの細胞のサイズより小さく、WM266-4およびWM115についてそれぞれ14.65±0.09μmおよび16.27±0.10μmであった。

両方の細胞株の細胞数は時間の経過とともに増加しました。 観察された増殖は、WM115 細胞株よりも WM266-4 細胞株の方が速かった。 WM115 の倍加時間は WM266-4 よりも長く、それぞれ約 7.5 日と 6 日です。これは、WM115 株の細胞が WM266-4 株の細胞よりも細胞周期に長い時間を費やすことを意味します。 スフェロイドの倍加時間 (DT) は通常、実際の腫瘍の倍加時間として特徴付けられ、スフェロイドの体積を使用して次のように計算されます。

ここで、V1 と V2 は、それぞれ播種後の時間 t1 と t2 = t1 + t における回転楕円体の体積です43、44、45。

蛍光強度分析 (図 6) によると、スフェロイドの中心から 100 ～ 200 μm の領域は増殖縁とも呼ばれる外層、内側の 50 ～ 100 μm の領域と考えられました。回転楕円体は壊死性コアとみなされました。 ただし、回転楕円体のさまざまな層のサイズは、回転楕円体のサイズによって異なります。 WM266-4 スフェロイドの端にある初期細胞数 1000 個から得られたスフェロイドの 4 日後の蛍光強度は、WM115 の蛍光強度よりも有意に高くはありませんでしたが (p = 0.20)、スフェロイドのより深い領域では、より高い強度が得られました。グルコースの取り込みは、WM115 スフェロイドよりも WM266-4 スフェロイドで観察されました (p = 0.00001)。 2000 個の細胞から形成されたより大きなスフェロイドは、4 日後により高いグルコース取り込みを示し、その強度は、WM266-4 スフェロイドと WM115 スフェロイドの増殖リム (p = 0.04) およびコア領域 (p = 0.0018) で有意に高かった。 8日目、WM266-4およびWM115スフェロイドは、増殖リム（p = 0.007）でのグルコース取り込み強度に有意な差を示したが、コアではそうではなかった（p = 0.064）（図6）。

黒色腫スフェロイドにおけるグルコース分布の決定。 グルコース濃度は、WM266-4 スフェロイド (A) およびより分散した WM115 細胞株 (B) の増殖縁に均等に分布していることが観察され、より大きく古いスフェロイドでは有意な差が見られます。 2-NBDG プローブを使用して評価した、2 つの異なる培養時点での WM266-4 (C) および WM115 (D) スフェロイド内のグルコース分布のプロット。

培養 4 日目には、初期細胞数 1000 のスフェロイドの蛍光強度として測定された低酸素症の進行に有意差はありませんでしたが (p > 0.05)、培養 8 日目には、WM266-4 スフェロイドの中心の低酸素症の程度が変化しました。は、WM115 スフェロイドのそれよりも有意に高かった (p = 0.0001)。 培養中の大きなスフェロイドでは、WM266-4 スフェロイドの低酸素度は WM115 スフェロイドよりも有意に高かった (p < 0.001)。一方、8 日目では、WM266-4 と WM115 スフェロイドは低酸素の進行に有意な差を示しました。中心部にはありますが (p = 0.00048)、外側の部分にはありません (p = 0.24) (図 7)。

黒色腫スフェロイドにおける低酸素の進行の決定。 低酸素領域は、(A) WM266-4 細胞株と (B) WM115 細胞株のスフェロイドの中心に観察され、より大きく古いスフェロイドでは大きな違いがあります。 Image-IT™ Green Hypoxia プローブを使用して評価した、2 つの異なる培養時点における WM266-4 (C) および WM115 (D) スフェロイドの低酸素分布のプロット。

スフェロイド内のオルト ポジトロニウム原子の平均寿命は、悪性度の異なる 2 つの異なる細胞株、WM115 と WM266-4 について確立されました。 両方の測定は、播種後 4 日目と 8 日目の 2 つの異なる時点でスフェロイドに対して実行されました。 生存率試験は、各 PALS 測定の前後に評価され、スフェロイドの生存率が 8 日目まで 85% 以上で一定に保たれることが示されました。 したがって、実験中、スフェロイドは良好で安定した状態にありました。

ポジトロニウム寿命の測定は３回繰り返した。 各測定では、スフェロイドをプレートから採取し、チャンバー内に配置しました。

図 8 は、2 つの異なる年齢における異なる悪性度レベルの 3D 黒色腫スフェロイドにおける平均 o-P 寿命と分布の結果を示しています。

さまざまな黒色腫細胞株の平均 o-Ps 寿命と強度の比較。 (左) 細胞播種後 4 日および 8 日という 2 つの異なる年齢における WM266-4 (黒い四角) および WM115 (赤い点) スフェロイドの o-P の寿命。 (右) WM266-4 スフェロイド (黒い四角) および WM115 スフェロイド (赤い点) における o-P 生成の強度を時間の関数として示します。 スフェロイド代謝に関連する平均 o-P を比較するには、補足ファイル 1 を参照してください。

表 1 に示す得られた結果は、悪性度が高く、増殖率が高く、スフェロイド内の細胞濃度が高い WM266-4 スフェロイドは、オルト ポジトロニウムの平均寿命が WM115 細胞よりも短く、したがって自由分子間空隙が小さいことを示しています。分裂速度が遅く、時間の経過とともに細胞の濃度が低下する原発腫瘍。 どちらの細胞株も培養中に o-P の寿命は徐々に減少しますが、o-P は WM266-4 スフェロイドよりも WM115 の方が長い寿命を示します。 WM266-4 スフェロイドの強度はほぼ一定のままですが、WM115 スフェロイドでは < 3SD > の強度の減少が見られ、これは WM115 スフェロイド細胞の分子レベルでの変化と考えることができます。

最近、ポジトロニウムイメージングが導入され 14、15、19、46、最初の in vitro ポジトロニウム画像が実証され 25、26、組織病理バイオマーカーとしてポジトロニウムを使用することにより癌診断改善の新たな可能性が開かれました 13、14。

この研究の主な目的は、ポジトロニウムががん細胞のさまざまながん活動や生物学的特性を評価するための新しいバイオマーカーとして機能する可能性があるという仮説を検証し、3D 細胞スフェロイドにおけるポジトロニウムの特性に関する最初の研究を実施することでした。 この仮説を検証するために、生理学的条件下で実際の腫瘍の構造を模倣できる 3D スフェロイドが使用されました。 3D スフェロイドの形態と細胞間相互作用は、単層細胞培養のものとは完全に異なります。 さらに、これらは標準的な研究方法に比べて、低コスト、高い再現性、時間の節約、実験動物モデルの必要性の低減など、一定の利点を持っています。 3D 腫瘍スフェロイドのユニークな特性により、化学療法や放射線療法に焦点を当てたさまざまな実験研究における生物学的実験や薬物試験に非常に貴重です 1,2,3,4,5,47,48。

単層細胞培養の細胞は均一な生物学的条件を備えているため、2D 細胞と 3D スフェロイドの細胞周期時間は大きく異なります。 コンフルエントな単層では、ほとんどの細胞が同じ細胞周期にあり、栄養素と酸素に十分にアクセスできます。 多層構造の 3D 細胞培養では、細胞は異なる細胞周期にあり、生存に必要な栄養素へのアクセスのしやすさは表面からの距離に依存します49。 細胞周期中、G1 期の細胞は、チェックポイントを通過した後に有糸分裂と分裂が始まる G2 期の終わりまで成長します。 スフェロイドでは、増殖のためのスペースが限られており、細胞が周期の G1 期で停止する静止層と、細胞が S 期に留まることができるスフェロイドの最外側の増殖リムに囲まれた壊死コアが形成されます。 /G2/Mフェーズ50。 私たちの研究では、スフェロイド形成と細胞増殖の動態に大きな違いが観察されました。 より悪性度の高い細胞株（WM266-4）は、より多くの細胞を含むより大きなスフェロイドを形成し（培養4日目と8日目の両方）（図5B、C）、スフェロイド内の細胞直径はより小さいことを観察しました。初代黒色腫細胞株 (WM115) のそれ。

これまでのポジトロニウム寿命研究は主に、皮膚がんや結腸直腸がん細胞など、さまざまな種類の組織や単層細胞培養で行われてきました20、21、22、23、46、51、52。 この新しい研究では、ポジトロニウムの寿命は、2D 細胞培養または組織ではなく 3D スフェロイドで評価されました。 材料や生体サンプル中のポジトロニウムについては多くの研究が行われていますが、3D 細胞凝集体を使用した研究は、細胞とコラーゲンの混合物を含む 3D 結腸直腸癌細胞凝集体における o-Ps 寿命の決定に限定されています 20。 o-P の平均寿命は、上皮細胞刺激に影響を与える成長因子 (TGF-β) で刺激された 3D 癌培養物における平均空隙量の高感度な指標であることが示されました。 TGF-β で処理したコロニーは、刺激後 2 ～ 3 週間で平均 o-P で増殖を示しましたが、培養後期には対照条件下での値まで減少しました 19。 この o-Ps 分布は、細胞の動態と平均分子空隙の間の関係の可能性を示しました。 小分子 (Å) の拡散挙動は、PALS を使用してさまざまな生体サンプル (毛髪、羽毛、綿、絹) で調査されており、o-P が生体ポリマーの空隙調査に敏感であることが示されています 53,54。 細胞内の o-P の寿命は、細胞表面、細胞成長、および細胞の形状が変化する可能性があるため、細胞が水、コラーゲン、またはその他の化合物を含む培地中にある場合に測定される寿命とは異なる場合があります。かわった。

私たちの研究では、2 つの異なる癌細胞株の自然増殖の初期段階に焦点を当てました。 これらの細胞株は細胞サイズが異なり、WM155 細胞は WM266-4 細胞よりも大きくなります。 したがって、スフェロイド形成中に、WM266-4 細胞はより高い増殖速度で小さいサイズを補い、より大きなスフェロイドを形成します。 それらの倍加時間は WM115 細胞よりも短く、WM266-4 細胞は WM115 細胞よりも細胞周期に費やす時間が短かった。 スフェロイド増殖の初期段階における細胞動態におけるこれらの重要な違いは、培養 4 日目の WM266-4 スフェロイドの o-Ps 寿命が短いことで示されました。 我々の以前の研究では、FDA/PI 蛍光アッセイ (酢酸フルオレセインとヨウ化プロピジウム) によって in situ で評価した生存細胞の割合を比較しましたが、スフェロイド形成の初期段階での細胞生存率に差異は観察されませんでした。しかし、WM266-4 と比較して WM115 スフェロイドではより大きな壊死コアが認められました (死細胞の 29.36 対 13.66%)38。 これらの結果は、グルコースおよび低酸素分布アッセイと一致しており、回転楕円体の中心は、グルコース濃度が最も低く、低酸素状態が最も高い領域として認識されました。 グルコース濃度の低下（おそらく拡散の減少または嫌気性代謝の増加、つまり解糖によって引き起こされる）が、古いスフェロイド（培養8日目）およびより多くの細胞から形成されたスフェロイドで観察されました（図6）。 興味深いことに、WM115 の不規則な形状により、蛍光プローブがコアの奥まで浸透することができ、回転楕円体の中心から 50 ～ 75 μm の領域で蛍光強度のピークとして観察されました (図 6D)。 このグルコースの利用可能性は、WM115 細胞株における嫌気性グルコース代謝 (解糖) を促進する可能性があり、これらの条件下での o-Ps 平均寿命の延長に関連している可能性があります。

また、2D 細胞培養物と 3D 細胞培養物における o-Ps の寿命を比較するために追加の測定も実施しました。 得られた結果 (図 9) は、ポジトロニウムの寿命が 2D 細胞培養よりも 3D 細胞培養の方が短いことを示しています 55。 このグラフは、平均 o-Ps 寿命が 2 次元細胞培養と 3D 細胞培養の間でどのように異なるかを示しています。これは、生物学的特性と代謝の多様性によるものです。 WM155 および WM266-4 細胞株は、アミノ酸輸送を担う遺伝子発現や、細胞接合の形成、遊走、移動性に関連する他の多くの遺伝子発現など、異なる遺伝子発現によって特徴付けられました 12,56。

黒色腫の 2D および 3D 細胞培養における平均ポジトロニウム寿命の比較。 参考文献55によるWM266-4 2D細胞培養におけるo-Pの寿命（黒四角）、WM266-4 2D細胞培養におけるo-Pの寿命（黒三角）、およびWM266におけるo-Pの寿命-4 3D 細胞培養 (黒い点) は、細胞播種後 4 日および 8 日の 2 つの異なる年齢のスフェロイドにおける o-P の寿命を示しています。

この研究は、さまざまな悪性度を特徴とする WM266-4 および WM115 黒色腫細胞スフェロイドにおけるオルト ポジトロニウムの生涯分布を評価するために実施されました。 測定は播種後の 2 つの異なる時点 (4 日と 8 日) で実行されました。 この期間中、どちらのスフェロイド細胞株も o-Ps 寿命の減少を示しましたが、これはスフェロイド内での段階的な細胞増殖に遡ります。 より悪性度の高い WM266-4 スフェロイドは、WM115 細胞株スフェロイドよりも短い o-Ps 寿命を示しました。

要約すると、結果は、o-P の寿命が、異なる生物学的特徴を持つ癌細胞を区別するための有用なパラメーターであることを示しています。 悪性度が高く、新生物細胞の増殖速度が高いほど、オルト ポジトロニウムの寿命は短くなります。 この研究は、細胞回転楕円体モデルを使用したポジトロニウム バイオマーカーの開発への道を開きます。

現在の研究中に生成および分析された、数値データ、数学的モデル、フィッティング グラフを含む計算結果を含むデータセットは、リンク https://ruj.uj.edu.pl/xmlui のヤゲウォ大学リポジトリ (RUJ) で入手できます。 /ハンドル/アイテム/29740557。

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この研究は、TEAM POIR.04.04.00-00-4204/17 プログラムを通じてポーランド科学財団 (FNP) によって支援され、ポーランド国立科学センターによって助成金第 1 号によって支援されました。 2019/33/B/NZ3/01004、2021/42/A/ST2/00423および2021/43/B/ST2/02150、プロジェクトCRP/0641.221.2020によるヤゲウォニア大学、SciMatおよびqLife優先研究領域予算プログラム Excellence Initiative—Research University、および DSC 助成金番号 N17/MNS/000023 ハニエ・カリミさん、博士研究のため。

医学物理学科、M. スモルホフスキー物理学研究所、ヤギェウォ大学物理学、天文学および応用コンピュータサイエンス学部、Łojasiewicza 11 Street、30-348、クラクフ、ポーランド

ハニエ・カリミ & エヴァ・シュ・スタンピエン

米国コロンビア、ミズーリ大学生化学教室

ハニエ・カリミ

ポーランド、クラクフのヤゲウォニア大学、物理学、天文学、および応用コンピュータサイエンス学部、M. スモルホウスキー物理学研究所、実験粒子物理学および応用学科

ポール・モスカル

ポーランド、クラクフのヤギェウォ大学、セラノスティクスセンター

パヴェウ・モスカル & エヴァ・ステピエン

ヤギェウォ大学化学学部、クラクフ、ポーランド

アガタ・ザク

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HK: 方法論、調査、執筆 - 原案、視覚化、レビューおよび編集、PM: 概念化、方法論、ソフトウェア、形式分析、リソース、データキュレーション、執筆 - 原案、レビューおよび編集、視覚化、監督、プロジェクト管理、資金調達取得、A.Ż.: 方法論、調査、E.Ł.S.: 概念化、方法論、調査、リソース、データキュレーション、執筆 - レビューと編集、監督、資金調達。

Ewa Ł. Stępień への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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カリミ、H.、モスカル、P.、Żak、A. 他。 ポジトロニウム バイオマーカー開発のための 3D メラノーマ スフェロイド モデル。 Sci Rep 13、7648 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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受信日: 2022 年 6 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 3 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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